在荷蘭格羅寧根大學(xué)的Martien Kas實驗室工作的貝蒂·霍尼克斯（Betty Hornix），通過這篇文章向大家非常詳細(xì)地描述了如何使用動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT）進(jìn)行視頻跟蹤設(shè)置并執(zhí)行小鼠嗅覺測試。

嗅覺和行為

人與動物之間的相互作用取決于適當(dāng)?shù)男嵊X處理，當(dāng)這個過程出現(xiàn)問題時，可能會影響正常的社交行為（Hornix等人，2018）。

正確分析嗅覺對于準(zhǔn)確解釋小鼠各種行為至關(guān)重要，尤其是觀察社交行為。下面我們將描述如何進(jìn)行嗅覺習(xí)慣/去嗅覺習(xí)慣測試。我們將解釋如何DIY自己的測試籠，哪些準(zhǔn)備工作是必要的，如何執(zhí)行測試，以及如何使用動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT）分析視頻。

嗅覺習(xí)慣測試

嗅覺習(xí)慣/去嗅覺習(xí)慣測試（OHDT）評估動物是否能夠檢測和區(qū)分不同的氣味。它由不同氣味的連續(xù)呈現(xiàn)組成。我們使用了一系列的水、兩種非社會性氣味和兩種社會性氣味。

每種氣味在持續(xù)2分鐘的三次連續(xù)試驗中呈現(xiàn)給動物（見以下時間表）。在這三次試驗中，氣味的嗅覺調(diào)查減少被定義為習(xí)慣化。當(dāng)出現(xiàn)一種新的氣味時，動物發(fā)現(xiàn)嗅覺增加時，會表現(xiàn)出一種被稱為去嗅覺習(xí)慣的整體行為。

最少的試驗操作

這里描述的方法，即嗅覺習(xí)慣/去嗅覺習(xí)慣測試，因為籠子內(nèi)部不受干擾，所以涉及較少試驗操作（Yang&Crawley，2009和Oumadi等人，2019）。由于氣味刺激物（500 ul試管內(nèi)的用棉花密封）不會接觸籠子或籠子蓋的任何部分，因此避免了交叉試驗污染。

如何制作自己的測試籠

該測試可以在需要進(jìn)行一些小調(diào)整的普通家庭籠中執(zhí)行。每天測試的每只動物都使用一個單獨的籠子，可以避免氣味留在籠子里。

我們在籠子的短邊燒了一個洞，用一個釘子在小錫罐上打了個洞。小錫罐用熱膠粘在每個籠子燒過的洞里（見下圖）。我們建議不要使用硅膠膠，因為氣味很重，希望盡量減少分散注意力的氣味。

氣味將通過這個錫罐呈現(xiàn)給動物。這樣，在測試過程中，保持籠子內(nèi)部不會受到干擾。

測試前的必要準(zhǔn)備

測試連續(xù)兩天進(jìn)行。第一天，動物適應(yīng)了籠子，并準(zhǔn)備好了氣味管。此外，清潔籠子，并填充了小墊層。我們使用了一種非常溫和的清潔劑來減少籠子里的氣味。

適應(yīng)和測試

動物適應(yīng)試驗籠

我們使用了500 ul的試管，通過錫罐向動物呈現(xiàn)氣味。每只動物需要準(zhǔn)備17根管子，管子的一端切掉（見下圖）。其中兩個試管中充滿了干棉簽。在準(zhǔn)備測試和執(zhí)行的每一步中都必須戴手套，盡可能防止氣味轉(zhuǎn)移。

下午，每只動物都要適應(yīng)測試籠30分鐘，同時將一根帶有干棉簽的管子插入錫罐中。

嗅覺刺激的準(zhǔn)備

測試當(dāng)天上午，氣味管準(zhǔn)備就緒。我們使用了水、杏仁提取物、橙子提取物、幼年糞便、成年糞便。之所以選擇杏仁和橙子提取物，是因為它們氣味非常特別，但氣味中性。

我們按照測試的順序（蒸餾水>杏仁（1:15）>橙子（1:5）>社會氣味1>社會氣味2）在水中和試管中準(zhǔn)備稀釋液，在不同氣味之間記得更換手套，不要觸摸棉簽的棉端（見上圖）。不要混合氣味是非常重要的！這是一項非常耗時的任務(wù)，所以要花足夠的時間來準(zhǔn)備一切。

執(zhí)行測試

該測試總共需要49分鐘，包括在開始時用一根新管握住一根干棉簽進(jìn)行5分鐘的馴化。氣味一次出現(xiàn)3次，每次持續(xù)2分鐘，ITI為1分鐘，總共15次試驗（見上述時間表）。我們使用多視頻錄制軟件（Media Recorder）從測試臺上方錄制視頻。

動物可以自由探索試驗籠。在準(zhǔn)備氣味時以及在動物變化之間需要非常小心（通過不斷更換手套），以避免轉(zhuǎn)移和混合氣味。

多只動物可以在它們自己的測試籠中同時進(jìn)行測試，只要注意準(zhǔn)確呈現(xiàn)氣味的時間，以便使用EthoVision XT 16成功進(jìn)行自動分析。

使用動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT）分析視頻

在動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT）中，當(dāng)動物的鼻尖位于我們在3.5厘米錫罐周圍數(shù)字標(biāo)記的區(qū)域內(nèi)時，我們測量了嗅氣味所花費的時間。

數(shù)據(jù)的提取和可視化

數(shù)據(jù)以1分鐘的時間段導(dǎo)出，并將每次試驗的2分鐘持續(xù)時間相加。我們通過繪制15次試驗中嗅氣味的時間來可視化結(jié)果。在這項實驗中，習(xí)慣和去習(xí)慣對非社會性氣味和第一種社會性氣味都非常有效。這是顯而易見的，因為在3次試驗中，每種氣味的嗅聞時間都有所減少。

此外，當(dāng)氣味變?yōu)樾職馕稌r，嗅聞時間會增加。此外，這些動物能夠以類似的方式區(qū)分第一種社交氣味和最后一種非社交氣味。他們更難區(qū)分這兩種社交氣味。我們建議使用特別的社交氣味，例如不同品種或更大年齡差異的氣味。

嗅覺的有效測試和自動化

總之，嗅覺習(xí)慣/去嗅覺習(xí)慣測試對于測試嗅覺功能和分離嗅覺行為中的不同特征非常有效。此外，這種方法使動物在測試過程中不受干擾，減少了動物壓力，使用動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT）自動化分析成為可能。

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